分析mRNA 穩(wěn)定性

由于 mRNA 的完整性和純度對于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至關重要，因此擁有監(jiān)測這方面的工具非常重要。mRNA分子的各種屬性共同決定了產品是否可以正常發(fā)揮作用。Poveda等人的綜述重點介紹了這些屬性，并簡要介紹了通常用于評價和監(jiān)控它們的方法。

表3提供了完整的分析評價方法列表，用于確定和監(jiān)測 mRNA 疫苗原料藥和終藥品的質量屬性和穩(wěn)定性。目前在公開資料中仍然無法獲得已獲批使用的mRNA-LNP疫苗產品的質量標準，泄露的相關文件中提到mRNA 完整性的百分比應在70% 到 75% 之間，EMA 的評估報告寫道：“在當前大流行的緊急情況下提交的這種醫(yī)藥產品的質量被認為是足夠一致和可接受的。"

表3 測定和監(jiān)測 mRNA 原料藥和 mRNA-LNP產品質量屬性和穩(wěn)定性。

縮寫：AF4，非對稱流場-流分餾；AFM，原子力顯微鏡；dsDNA，雙鏈 DNA；DLS，動態(tài)光散射；ESEM，環(huán)境掃描電子顯微鏡；IEX-HPLC，離子交換高效液相色譜；IP-HPLC，離子對高效液相色譜；MALS，多角度光散射；NTA ，納米粒子追蹤分析；qPCR，定量聚合酶鏈反應；RP-HPLC，反相高效液相色譜；SE-HPLC，體積排阻高效液相色譜；TEM，透射電子顯微鏡；TRPS，可調電阻脈沖感應。

在這里，我們詳細介紹了適用于研究 mRNA 完整性和用于質量控制 (QC) 的技術。Schmidt 概述了歐盟當局要求的以 mRNA 疫苗為重點的研究藥品檔案 (IMPD) 的質量文件，感興趣的讀者可以參考該信息性文件了解詳細信息。由于許多描述的方法旨在檢測裸露的 mRNA，而mRNA 疫苗包封在 LNP中，因此對于某些檢測，首先需要從LNP 中釋放出mRNA，可以通過適當的控制來考慮此過程的潛在影響。

凝膠電泳是一種常用的技術，可以提供有關 mRNA 大小和完整性的信息。當 mRNA 降解并發(fā)生鏈斷裂時，mRNA 鏈變短。因此，預期 mRNA 長度處的條帶強度會降低或條帶會變寬，同時可能會出現新的條帶。

Démoulins等人使用凝膠電泳法分析了在無RNase 條件下SAM 的質量。根據凝膠電泳數據，他們能夠確定 mRNA 是否具有可接受的質量和穩(wěn)定性，目前已研發(fā)出商用電泳設備用于 mRNA 的高通量分析。

張等人報道了熒光相關光譜 (FCS) 可用于監(jiān)測 mRNA 大小的變化，主要原理是通過熒光標記的mRNA 的布朗運動來計算分子量。然而，這種技術需要熒光標記，與凝膠電泳相比準確度并不一定更高，并且只能檢測到包括分子量發(fā)生變化的mRNA 降解，例如鏈斷裂等。

在整個（生物）制藥行業(yè)，色譜技術形成了一個強大的平臺來監(jiān)測藥物的純度和穩(wěn)定性。然而，迄今為止，用于確定 mRNA 分子純度和穩(wěn)定性的HPLC技術的開發(fā)進展緩慢。分析大 分子mRNA的成功方案可以在文獻以及闡述 RP-HPLC、SE-HPLC、IP-HPLC 和 IEX-HPLC 方法的文獻中找到，其中一些技術也可用于mRNA 制備純化。IEX-HPLC 可用于測量游離和LNP 包封的 mRNA。前面提到的RiboGreen技術可以建立相同參數的正交技術，然而使用相同的mRNA-LNP樣品卻測定出了不同的含量結果；與RiboGreen 數據相比，IEX-HPLC 結果與體內數據的相關性更好。這說明即使是像 RiboGreen 檢測這樣的成熟技術，也應該根據具體情況進行詳細驗證。

mRNA 降解也可以通過RT-qPCR進行分析，使用方法可以測定能轉錄成完整目標cDNA的mRNA 總量，這表明所有影響這個過程的因素都可以間接定量檢測。Brisco 和 Morley對 RT-qPCR技術進行評估，認為它的定量結果是可靠的。RT-qPCR技術的另一個優(yōu)點是能定量檢測影響轉錄的所有類型的降解，而之前討論的其它技術只能檢測mRNA 的大小。然而，，RT-qPCR 技術也有一定的局限性，由于所用酶存在錯誤率，導致結果有時不太可靠。而且RT-qPCR 技術這目前沒有被廣使用，并且無法區(qū)分不同類型的降解。

mRNA體外（細胞內）表達也用于分析mRNA的完整性，通過使用編碼熒光蛋白的mRNA，可以通過測量熒光信號間接確定mRNA 的完整性。這種方法有助于為生物活性 mRNA-LNP 設計和chu方篩選研究提供指導。或者，可以使用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 或蛋白質印跡技術（WB）來確定編碼非熒光抗原的mRNA 的翻譯功效。這種方法的優(yōu)點是它給出了制劑的整體完整性和可能影響 mRNA 轉錄的所有因素的總和。這種方法的局限性是不是很精確，無法明確mRNA破壞的類型，并且耗時。