輔助生殖技術--卵母細胞冷凍的現狀

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卵母細胞冷凍的成功依賴于影響卵母細胞冷凍后復蘇的形態學和生理上的因素。人類卵母細胞，對低溫非常敏感，因為其體積及生理方面的因素,在細胞內冰晶形成過程中，很容易遭受死亡或亞死亡性損傷。重要的生理因素是細胞在冷凍過程中冰晶形成導致的細胞膜或細胞器破裂,但適當的細胞脫水可阻止這種情況，因此減少細胞內的水分可減輕冷凍過程對細胞的損傷。脫水的過程受平衡液及冷凍液的濃度影響，在細胞脫水時兩者比例合適,可減少冰晶造成的損傷、滲透壓改變造成的損傷、細胞骨架和染色體的改變等，zui后細胞在經歷冷凍過程后存活[1]。

對冷凍保護劑的研究一直未間斷過。冷凍保護劑是一種合理的鹽類緩沖液,似乎可減少高鹽對細胞的損害。冷凍保護劑包括:滲透性保護劑,如丙二醇(propanediol ,PROH)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、二甲亞砜( dimethyl sulfoxide , DMSO)等;非滲透性保護劑,如蔗糖、海藻糖、聚乙二醇等。聯合使用玻璃化冷凍保護劑可降低毒性，提高保護作用。如Gautam等[2]采用玻璃化冷凍及慢速冷凍牛卵細胞時發現,EG和DMSO混合物是一種有效冷凍保護劑，使用這種冷凍保護劑可提高卵細胞存活率、卵裂率及囊胚形成率,玻璃化冷凍程序配合合理冷凍保護劑更適宜卵母細胞冷凍。玻璃化冷凍的基本原理是高濃度冷凍保護劑經急速降溫后,由液態轉化為外形類似玻璃化的非晶體化固體狀態。由于冷卻諫度很快，以至干在低溫形成透明的玻璃狀周體時沒有冰晶形成,保留細胞內外液體正常的分子和離子分布。適宜的冷凍保護液是目前玻璃化冷凍卵母細胞的焦點，而海藻糖在此方面表現出明顯優勢并逐漸得到重視。

海藻糖在冷凍卵母細胞中的應用

Eroglu等研究發現,使用0.5mmol/L的海藻糖聯合0.5mmol/L的DMSO對人類卵子進行玻璃化冷凍，結果冷凍后卵母細胞獲得較高的成活率,而與新鮮卵母細胞比在受精率和胚胎發育率上無統計學差異。

Eroglu等研究小鼠卵母細胞內注射0.1mol/L的海藻糖,利用高xiao液相色譜和脈沖電流檢測儀對卵母細胞內的海藻糖行追蹤研究。研究發現,在卵母細胞第1次卵裂時卵母細胞內的葡萄糖濃度明顯高于對照組,且胞內海藻糖濃度減少40%;而在注射早期以及囊胚形成期兩者胞內的葡萄糖濃度的差異不大，海藻糖的濃度在囊胚階段減少5倍。這種不同可以解釋為海藻糖轉化為葡萄糖的代謝和葡萄糖轉運體的表達增加,使胞內海藻糖濃度減少。卵裂時海藻糖由二糖轉變為單糖供卵母細胞利用,而對卵母細胞本身無任何du害作用。

Berlinguer等對未成熟的羊卵進行研究,發現用海藻糖添加的體外成熟培養基中成熟的羊卵與未使用海藻糖對照組比，受精率(92.5%比91.1%)

卵裂率(95.4%比96. 1% )囊胚形成率(13%比14.3%)無明顯差異,但利用碘化丙啶(propidium iodide ,PI)對細胞染色發現,海藻糖組細胞完整性明顯高于對照組,說明在穩定細胞膜的結構、冷凍和復蘇過程中的發育潛能方面,海藻糖組羊卵未受到影響。

Hamaratoglu等[7]認為,海星卵母細胞在慢速冷凍過程中很容易死亡,原因是這種卵母細胞對滲透壓高度敏感和在零下溫度極易形成胞內的冰晶,所以普通冷凍方法無作用。研究發現,將卵母細胞短暫放置于1.5mol/LDMSO和1mol/L的海藻糖中快速冷凍,結果34%卵母細胞成活。說明新的用于海星卵母細胞冷凍的方法是可行的。

海藻糖是生物大分子非特異性的天然保護劑，其在生物領域特別是卵母細胞的玻璃化冷凍方面有更加廣fan的應用前景。進-步尋找有效且安全的海藻糖載入卵母細胞內的方法,在聯合其他滲透性保護劑的基礎上利用海藻糖特殊的功能對卵母細胞冷凍保存,探索到一種更適合于冷凍卵母細胞的方法,為人類輔助生殖技術的發展提供動力。

為什么海藻糖可以被應用到冷凍卵母細胞中？這就得從海藻糖的應用原理說起。

在高溫、高寒、高滲透壓及干燥、脫水、冷凍時等惡劣環境條件下，海藻糖在細胞表面能形成*的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。目前海藻糖已用于多種生物細胞研究，如：紅細胞、血小板及生殖細胞等的離體長期保存，且均表現出*的功能。海藻糖的發現為低溫保存卵母細胞提供可利用的價值，其作為冷凍保護劑對卵母細胞進行玻璃化冷凍成為新的冷凍技術方法。海藻糖的作用原理包括：“水替代”假說、“玻璃態”假說、“優先排阻”假說。

“水替代”假說。認為,海藻糖能與生物分子形成氫鍵,代替空間結構必需的水分子。即生物體內的蛋白質核酸、糖類、脂質類及其他生物大分子周圍均包著一層水膜,這層水膜是維持生物大分子結構、功能的物質基礎,當干燥、冷凍等條件下失去水膜時,海藻糖分子能在失水部位與生物大分子以氫鍵連接,形成一層保護膜代替失去的結構水膜,而不至于使生物分子喪失活性[1]。

“玻璃態”假說。海藻糖的高xiao生物保護作用與其玻璃態形成有關。海藻糖水溶液干燥時黏度隨濃度的增加而增大，當達到一定濃度且糖未結晶時，其水溶液就會玻璃化,這種狀態稱為玻璃態。“玻璃態”假說認為,當生物成分干燥時,海藻糖緊密地包住相鄰的分子,形成一種在結構上與玻璃狀的冰類似的碳水化合物玻璃體,其擴散系數很低,分子運動和分子變性非常微弱,能夠使生物分子維持-定的空間結構[2]。

“優先排阻”假說。海藻糖等小分子糖類不直接與蛋白質空間結構相互作用,而是優先與蛋白質表面的水分子結合，結果蛋白質的溶劑化層半徑減小，分子結構更緊密,構象更穩定,有利于抵御外界環境的影響。該假說可解釋溶液中海藻糖對生物分子的穩定作用。海藻糖水合體積為蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖的2.5倍,在溶液中可結合更多的水分子。這-結果可很好地解釋海藻糖保護生物分子的效果優于其他低聚糖的原因[3]。